对青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg)复合种群6个局部种群的遗传多样性进行了RAPD分析。通过11个引物扩增到117个显性位点,其中多态性位点平均为62.86%,各百合群体多态性位点多少顺序为Y5、Y1、Y4、Y6、Y2、Y3。把RAPD多样性指标与样地的基本状况进行相关分析,发现海拔高度、样地坡度和植被类型与各个多样性指标呈正相关,样地坡向与各个多样性指标呈负相关。Nei’s基因多样度指数(h)和Shannon信息指数(I)的统计结果表明,种群内h和I的平均值分别为.23 4和.39 ,这两个指数均为Y5最高,其次为Y1,Y3最低。不同位点在种群间的分化程度差别很大,基因分化度的波动范围为.16 5~.942 7,平均为.378 3。种群间平均基因流为.821 6,说明有遗传漂变的存在。6个百合种群间遗传一致度与遗传距离的无偏估计表明,最小的遗传距离在Y4和Y6之间,最大的遗传距离在Y3和Y5之间,遗传一致度则相反。种群聚类分析表明,Y1和Y2比较近;Y4和Y6比较近又和Y5联系在一起。Y3比较特殊,单独为一类。 
  关键词青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg);复合种群;遗传多样性;RAPD;遗传漂变;遗传距离 
  中图分类号S682.2; 文献标识码A 文章编号439-8114(214)13-374-4 
  RAPD Analysis of Genetic Diversity of the Lilium tsingtauense Metapopulation 
  ZHANG Cong-min1,ZHANG Zhi-guo2 
  (1. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou 363, Fujian, China; 
  2. School of Life Sciences, Shandong University, Jinan 251, China) 
  Abstract Genetic diversity of six Lilium tsingtauense metapopulations were studied with the method of RAPD. The genetic differentiation among populations was analyzed by STATISTICA. 117 loci were amplified by RAPD. The means of genetic diversity within population was 62.86%. The order was population 5> population 1> population 4> population 6> population 2> population 3. Altitude, plot slope, vegetation types and various diversity index was positively correlated. But plots slope and various diversity index was negatively correlated. The result of Nei’s gene diversity index (h) and Shannon(I) Information showed that the mean was .23 4 and .39 . These two indices were both the highest in population 5, but the lowest in population 3. Genetic divergence of all RAPD loci among populations was different from .16 5 to .942 7, with the mean of .378 3. The change of gene flow was inverse to the change of genetic divergence. The means of gene flow was .821 6, less than 1, indicating that there was genetic drift among populations. From Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance by RAPD, it was conducted that the lowest genetic distance was between population 4 and population 6, with the highest genetic identity between them. 
  Key words Lilium tsingtauense; metapupulations; genetic diversity; RAPD; genetic drift; genetic distance 
  青岛百合(Lilium tsingtauense Gilg)是我国百合科的特有种,已列入第二批国家保护植物名录1。由于栖息地干扰的加剧,青岛百合的分布范围日趋缩小,目前,青岛百合的集中分布地位于崂山北九水以南海拔4~1 m的森林群落内,这一区域可见到成片分布的种群,均呈斑块状分布,斑块之间的距离依地形、地貌及人类活动的强度不同而远近不一,以复合种群存在2。
  目前对百合的研究在国内已有不少报道,主集中在其地理分布、化学成分、组织培养、细胞学观察及杂交育种等方面,但鲜见关于青岛百合的研究。一个物种的稳定存在与其群体的遗传多样性水平和遗传结构密切相关3,因此对青岛百合遗传结构的研究将有助于探讨其濒危原因及过程,采取科学有效的措施进行保护,并且能为其分类、进化研究供资料,进而为育种和遗传改良供遗传学依据。RAPD技术是一种简便、快速、易行的分子标记技术,试验用RAPD技术分析了青岛崂山6个样地(Y1~Y6)的青岛百合复合种群的遗传多样性、群体内和群体间的遗传变异,旨在为青岛百合遗传结构的研究供依据。 
  1 材料与方法 
  1.1 材料 
  试验从6个样地(Y1~Y6)各随机取2株青岛百合的幼嫩顶芽,迅速置于冰盒中带回实验室于4 ℃保存,7 d内进行总DNA的取。 
  1.2 方法 
  1.2.1 基因组DNA的取 6个样地共12份样品,采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法4稍作修改后取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳,LALBWORKS3.成像,Labimage2.6分析确定各梯度的DNA浓度和纯度,-2 ℃保存备用。 
  1.2.2 引物的筛选 从Operon公司3个引物中筛选出7个产物稳定、多态性高、模板浓度适应性强的引物;从Sangon公司的2个RAPD引物中筛选出4个,在Sangon公司合成,并与筛选用引物对照,扩增结果一致。共用引物11个,序列见表1。 
  1.2.3 RAPD扩增 参考Koppitz4和Hofstra等5的方法,通过对反应体系中各成分的优化,建立了最佳反应体系,总体积25 μL。包括6 ng基因组DNA,1 pmol随机引物,2.5 mmol/L dNTP、1U Taq DNA聚合酶,25 mmol/L MgCl2等。反应程序为94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸2 min,4个循环;最后72 ℃延伸7 min。扩增反应在德国BIOMETRA-GRANDIENT PCR仪上进行。 
  1.3 RAPD数据的统计 
  1.3.1 多态性位点比例(P) P=多态性位点数/位点总数,对某一位点,隐性频率(q)和显性频率(P)均超过.5即记为多态性位点。 
  1.3.2 Nei’s基因多样度指数(h) 对某一位点,h=1-(p2+q2);对某一种群,种内基因多样性 Hs(Nei’s)=∑h/n,其中n为位点总数;种群总基因多样度HT=∑1-(pi2+qi2)/n,其中n为位点总数,pi和qi分别为总的种群中i位点上的显性频率和隐性频率。 
  1.3.3 Shannon信息指数(I) 对某一位点,I=-∑(log2Xi)xi,其中Xi为该位点上第i个等位基因的频率。 
  1.3.4 种群间基因分化度 GST=(HT-HS)/HT 
  1.3.5 基因流 Nm=.5(1-GST)/GST 
  2 结果与分析 
  用Popgen32软件包对获得的RAPD“,1”矩阵进行处理,获得种群遗传多样性和种群遗传结构的基本信息,再用Statistica对种群间的遗传分化规律进行进一步的统计分析。11个随机引物扩增到117个显性位点,平均每个引物检测到1.64个位点。 
  2.1 种群内遗传多样性RAPD分析 
  由表2可知,种群内RAPD多态性比例(P)平均为62.86%,这在植物种群中是比较高的。在所有样地中,Y5的P最高,为69.23%,其次是Y1,为65.18%。Y3的最低,为57.26%,按检测到的多态位点比例排序,各百合群体顺序为Y5>Y1>Y4>Y6>Y2>Y3。 
  种群内平均每个位点的等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)的平均值分别为1.629 6和1.339 5。这两个多样性指数仍然是在Y5和Y1两个种群中较高,Y5的Na值最高,Y1的Ne值最高,说明在Y1中等位基因的频率分布相对均匀一些,而Y5中含有较多频率较低的等位基因。Na和Ne的最低值均出现在Y3种群中,分别为1.572 6和1.283 3。 
  Nei’s基因多样度指数(h)和Shannon信息指数(I)是测度种群遗传多样性的重指标。种群内h和I的平均值分别为.23 4和.39 。前者只有后者的65.82%,这两个指数均在Y5中最高,其次是在Y1中较高,在Y3中最低。另外,包含所有种群的总的遗传多样性明显高于任何一个种群内的遗传多样性,说明有相当的遗传变异存在于种群之间。 
  由表3和图1可知,海拔高度、样地坡度和植被类型与各个多样性指标呈正相关,即随着海拔的升高、样地坡度的增加和植被类型复杂程度的增加,各个多样性指标值增加;另外,样地坡向与各个多样性指标呈负相关,即阴坡比阳坡的各个多样性指标高,这符合青岛百合适宜阴湿环境的情况。Na值降低,而Ne、I、h值升高,相反地,随着样地植株数目的增加,多样性指标的P、Na值升高,而Ne、I、h值降低。 
  2.2 种群间的遗传结构与遗传分化 
  2.2.1 种群间的遗传分化 不同位点在种群间的分化程度差别很大,最极端的情况是没有分化(GST=)和完全分化(GST),除掉这两种极端情况,RAPD位点上基因分化度的波动范围为.16 5~.942 7,最小值的位点为OPD5-1,最大值的位点为OPQ9-4。基因流的变化趋势与基因分化度相反,基因分化度越高,基因流越小,基因流的波动范围为.28 ~29.88 9。 
  不同位点上基因分化度的差别如此之大,可能与空间隔离的种群在不同生境中产生新的体细胞突变有关。 
  所有位点基因分化度的平均值为.378 3,说明对研究的6个百合种群来说,有37.83%的基因多样度存在于种群间,62.17%的基因多样度存在于种群内。种群间平均基因流为.821 6,略小于1,说明有遗传漂变的存在。
  2.2.2 种群间遗传结构与遗传距离 表4是RAPD分析对6个百合种群间遗传一致度与遗传距离的无偏估计,最小的遗传距离在Y4和Y6之间,为.132 6,最大的遗传距离在Y3和Y5之间,为.247 。相反,Y4和Y6之间的遗传一致度最大,为.875 8,Y3和Y5之间的遗传一致度最小,为.781 1。 
  2.2.3 聚类分析 6个种群的RAPD分析见图2。从图2可以看出,Y1和Y2比较近;Y4和Y6比较近又和Y5联系在一起。Y3比较特殊,单独为一类。 
  3 小结与讨论 
  3.1 种群的遗传结构及其影响因素 
  进化的基本单位不是个体而是种群,进化就是种群基因库的改变6。种群遗传结构就是遗传变异或者说基因和基因型在时间和空间上的分布式样。对植物群体遗传结构及其影响因子的研究是群体遗传学中的重课题,是探讨植物的适应性、物种形成过程和式样及其进化机制的基础,也是保护生物学的核心。 
  种群遗传结构是一个物种最基本的特征之一,它受突变、基因流、选择和遗传漂变的共同作用,同时还和物种的进化历史和生物学特征有关,本试验结果表明不同位点在种群间的分化程度差别很大,可能与空间隔离的种群在不同生境中产生新的体细胞突变有关。青岛百合种群间的平均基因流为.821 6,略小于1,说明有遗传漂变的存在。另外,基因流的变化趋势与基因分化度相反,如果说自然选择是导致种群分化最主的进化力量,那么基因流则是对抗选择作用的重因素6。在植物中,基因流是借助于花粉、种子、孢子、营养体等遗传物质携带者的迁移或运动来实现的,青岛百合可能是通过水流带动种子的流动,这些共同影响着青岛百合的遗传结构。 
  3.2 青岛百合遗传结构研究中分子标记的选择 
  青岛百合作为我国百合科的特有种,已列入第二批国家保护濒危植物名录1。因此,研究青岛百合的遗传结构对保护青岛百合具有重意义,在此正确选择分子标记非常重。目前用于研究植物遗传标记有等位酶、RAPD、ISSR、AFLP、STS等,对同一问题,不同标记获得的结果可能不同,为了客观反映种群的自然状况,应仔细研究所解决的问题和可供选择的分子标记的特点,以保障所选的分子标记对于解决所研究的问题为最佳选择。 
  对个体差异灵敏度高的分子标记如RAPD、ISSR、DAF(DNA指纹)等用于中、小尺度上遗传变异的研究可能获得较好的结果,这些变异用于检测种群遗传变异的时间动态特征也比较适宜。由于青岛百合成斑块状分布,分布范围较狭小,再加上现有的实验设备,选用RAPD技术可获得稳定而可靠的结果。 
  3.3 对青岛百合复合种群的保护建议 
  1)应在青岛百合分布区崂山北九水自然风景区实行真正意义的限额采伐,某些地域应禁止采伐和开发,实际上自从划出禁游区以来整个青岛百合种群有繁茂的趋势。 
  2)将青岛百合分布较密集、生长较好地区划为以青岛百合为重点的省级自然保护区,对青岛百合实行就地保护。禁止在保护区内采伐、放牧,教育当地农牧民树立保护自然就是保护人类的思想,减少人为活动对它的破坏。 
  3)在对青岛百合就地保护的同时,积极向适合其生长的环境中引种,实行迁地保护,增加人工种群数量。根据在青岛、海阳、即墨植物园的栽培情况,可以推断在青岛地区均可引种青岛百合。 
  4)在现有研究基础之上,对青岛百合复合种群应继续进行跟踪研究。青岛百合种群具有年龄易确定、分布区集中、分布区域明确等特点,是研究植物复合种群很好的材料。继续对青岛百合复合种群空间格局及繁殖、迁移等动态过程进行跟踪研究,不仅使得青岛百合复合种群的研究更加完善,加强对这一国内特有种的保护,而且对其他植物的复合种群研究也将有重的指导意义。 
  参考文献 
  1 王仁卿,张昭洁.山东稀有濒危保护植物M.济南山东大学出版社,1993. 
  2 张聪敏,王仁卿,张治国.青岛百合生境特点和分布现状研究J. 湖北农业科学,21,49(6)144-141. 
  3 夏 铭,周晓蜂,赵士洞.天然红松林群体遗传多样性的RAPD分析J.生态学报,21,21(5)73-737. 
  4 KOPPITZ H.Analysis of genetic diversity among selected populations of Phragmites australis world-wideJ.Aquatic Botany, 1999,64(3-4)29-221. 
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  6 GRANT V.The Evolutionary ProcessA Critical Study of Evolutionary TheoryM.New YorkColumbia University Press,1991.